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1915年（民国四年）11月26日“物产陈列所”成立，内藏图书及文物，所址原为俄清银行旅顺分行。
1916年（民国五年）11月22日于松树町开辟新馆址，“物产陈列所”内文物迁入，改“物产陈列所”为“关东都督府满蒙物产馆”，此址历史上称“参考部”“考古部”“分馆”。
1917年（民国六年）4月1日“关东都督府满蒙物产馆”对外开放。同年，于原沙俄拟建“陆军将校集会所”基础上开工建博物馆主馆大楼。
1918年（民国七年）4月1日馆名改称“关东都督府博物馆”，11月6日博物馆主馆大楼基本完工，馆址迁至。
1919年（民国八年）4月12日因关东都督府改制，馆名改称“关东厅博物馆”。
1925年（民国十四年）11月分馆文物迁至主馆大楼，分馆改做博物馆的图书馆。
1934年（民国二十三年）12月26日馆名改称“旅顺博物馆”。
1951年（民国四十年）1月29日苏联政府将“旅顺东方文化博物馆”管理权及附属动物园管理权移交中国政府。8月30日大连劳动人民历史文化陈列所并于旅顺东方文化博物馆。11月苏联红军接管旅顺，十月接管旅顺博物馆，馆名改称“旅顺东方文化博物馆”。
1952年（民国四十一年）12月馆名改称“旅顺历史文化博物馆”。
1954年（民国四十三年）4月1日郭沫若题写馆名改称“旅顺博物馆”。
1972年（民国六十一年）5月1日旅顺博物馆在“文革”闭馆后恢复开放，基本陈列为《历史文物专题陈列》。
1999年10月旅顺博物馆实施总体改造工程，将植物园、动物园一半与旅顺博物馆园区合并，园区扩大为15万平方米，主馆大楼全面维修。
2001年4月，旅顺博物馆分馆落成开馆，基本陈列为《大连古代文明》及《馆藏外国文物专题陈列》。
2008年5月，旅顺博物馆被国家文物局评为首批“国家一级博物馆”。
2012年12月，旅顺博物馆新建现代化文物库房竣工并通过验收。
2014年，旅顺博物馆被辽宁省科学技术厅授予“辽宁省科学技术普及基地”。
围绕旅顺博物馆藏文物开展综合性科学研究，是旅顺博物馆学术规划的重要内容。旅顺博物馆与海内外学术机构进行了广泛的交流与合作，举办了旅顺博物馆藏佛经残片国际学术研讨会，唐鸿胪井石刻国际学术研讨会等国际学术会议。出版了《旅顺博物馆藏佛经研究论文集》、《旅顺博物馆藏汉文佛经残片选》、《西域出土梵文佛经残片》、《旅顺博物馆藏新疆出土文物研究文集》、《旅顺博物馆》、《旅顺博物馆藏画选》、《旅顺博物馆藏铜镜》、《旅顺历史与文物》、《清孙温绘红楼梦图册》《旅顺博物馆精品文物选粹系列丛书》《旅顺博物馆95年简史》等多部著作，馆内业务人员发表考古报告及学术论文达数百篇。为了加强人才培养、推动学术研究，大连市文化广播影视局还在旅顺博物馆的基础上，成立了大连市历史文物研究所。旅顺博物馆已经与日本、韩国、朝鲜、俄罗斯等国外多所文博单位、科研院所开展合作，从多学科、多角度对馆藏文物进行深入研究。
博物馆拥有丰富的藏品资源，以藏品为基础开展学术研究活动，是博物馆一直坚持的原则。馆内现有专业人员30多人，其中正、副研究员9人，这些人都具有丰富的工作经验和扎实的业务研究能力。馆内非常重视专业人员的学术研究及创新活动，鼓励他们多出成果、出好成果，并通过举办展览、出版专著等形式展示他们的学术成果。博物馆还连续多年与国内外的学术机构及团体进行学术交流与合作，并取得可喜成绩。2012年5月，旅顺博物馆启动了国家社科基金项目《旅顺博物馆馆藏殷墟甲骨文的整理与研究》。
丰富的藏品资源为博物馆开展学术交流奠定了基础，自上世纪六十年代起，就不断有专家学者来博物馆进行文物鉴定及授课活动。博物馆采取“请进来，走出去”的方式扩大了与国内外高等学府及学术机构的交流与合作，一大批业务骨干脱颖而出，极大地增强了博物馆的学术研究力量。
2014年，旅顺博物馆有馆藏文物有6万余件，其中一级文物200余件。比较珍贵的有：青铜器吕鼎，内底铸有铭文5行44字。“吕”即西周穆王司寇吕侯；西汉时期的马蹄金；元代刘秉谦“竹石图”。还有新疆出土南北朝至唐代9具木乃伊和丝织品、绢画、陶俑、货币等汉、唐文物，以及印度犍陀罗石刻和日本绘画等外国文物。旅顺博物馆的藏品以大连地区考古出土文物、新疆文物及中外传世的历史艺术类文物为主体，形成了独具特色的历代艺术精品荟萃，文物类别丰富，突出不同地域文物鲜明特征的藏品体系。藏品涵盖考古、铜器、陶瓷、甲骨、玉器、漆器、珐琅器、书画、碑志、佛教造像、竹木牙雕、新疆文物、外国文物、货币等20个门类。其中尤以书画、新疆文物、印度犍陀罗艺术和罗振玉《三代吉金文存》、《贞松堂集古遗文》著录的商周时期青铜器等*特色和影响。
旅顺博物馆藏青铜器在国内外有重要地位，其时间跨度从商代至辽金时代，种类有兵器、礼器、乐器、水器及杂器等，许多器物上铸刻铭文，如洛阳武库钟、冉钲、父乙鬲、父辛甗、吕鼎等。尤其大梁鼎、过伯簋、始皇二十六年诏五斤权等器物的铭文均有确切纪年，不仅可以证信古史、补苴史书的缺佚，而且对研究商周至秦汉的历史和语言文字，都有着重要价值。
馆藏书画作品别具一格。元代刘秉谦《竹石图》，以双勾技法画竹，笔力雄健，题“至正乙未（1355年）春寿阳刘秉谦为克明未宪掾作。”然而，刘秉谦及其作品均不见画史，《竹石图》为传世孤品，对研究元代绘画弥足珍贵。明清两代书画名家辈出，艺术流派纷呈，各流派代表人物的作品，馆内均有收藏。值得一提的是，其中不少作品为清宫旧藏。如明沈固的《青园图》、文征明的《老子像》、唐寅的《松林扬鞭图》、清王翚的《观梅图》、上睿的《携琴访友图》等。康熙皇帝跋《兰亭序》、跋《曹娥碑》及临王羲之、米芾、苏轼、赵孟頫、董其昌等历代书法名家的墨迹，对研究清代书法史更是难得的珍贵史料。
新疆文物是馆藏一大特色。其内容包括绢画、写经、印经、文书、版画、壁画、章、木器、丝织品、泥塑彩绘佛像、菩萨像和木乃伊等。在这些藏品中，佛教文物数量较大，有汉、梵文《妙法莲华经》，《大般涅盘经》和梵文、回鹘文、和阗文、吐火罗文佛典。其中公元五~六世纪的《法华经》残片，是迄今已知世界上最古老的梵文《法华经》写本，《诸佛要集经》则是中国最早的佛经译本。
每周二至周日9：00——16：00（每周一闭馆，重大节假日除外）
2013年4月，旅顺博物馆主馆、分馆、关东军司令部旧址博物馆实现全面免费开放，游客凭有效证件入馆参观。
区内公交1路、2路、3路、6路等可直接到达。
《历史文物专题陈列》是旅顺博物馆主馆陈列的基本体系。依托于丰富而有特色的馆藏，以《古代青铜器》作为展览的开篇，全年展出《古代漆器》《古代珐琅器》《古代玉器》《东亚三国古代陶瓷》《新疆干尸木乃伊》《古代书画》《古代砚台》《中国古代佛教造像》《中国古代货币》八个专题。展览以自然采光为主，设有语音导览和多媒体查询等辅助设施。
分馆于2001年5月正式对外开放。一层为通篇的《大连古代文明》的三个展室，二层为《中国箸文化展》《丝绸之路文物展》。全部展厅以全封闭展出环境、人工采光为主，兼顾各类文物的安全保护，用以全方位服务于展览过程中的学术演讲和现场演示
关东军司令部旧址
关东军司令部最早的旧址就坐落于旅顺太阳沟景区，该建筑为近代俄罗斯风格，主体是二层半砖石木框架结构，建筑面积2602平方米，附属占地面积94平方米主楼外形酷似一座长方形的堡垒。
塔基用花岗岩砌成，呈正方形，长宽各22米。为双重月台，周围是石雕栏杆，四面阶梯。在12角形塔身下部，雕有高达1.2米的20个神态各异的中苏两国人民群像。塔的尖端用雪花石雕刻一朵盛开的莲花，托着中苏友谊徽和一只展翅欲飞的鸽子，象征着中苏友谊和两国人民的伟大团结。塔的周围栽有78株四季常青龙柏。
旅顺博物馆的文物保护工作目前由文物应用技术部全面负责，它的前身是20世纪50年代末期成立的修复室，1992年，组建技术部，1999年，又取消技术部，归入保管部，直到2007年，设置了文物应用技术部。下设书画装裱与修复、器物修复与复制、纺织品修复、匣囊制作等岗位，每个岗位都有专业的技术人员，有工作人员6名。2008年获得辽宁省文物局颁发的可移动文物修复二级资质证书，具备修复书法绘画、陶瓷器、铜器、织绣、古籍善本类文物的能力。现有书画修复室、器物修复室、纺织品修复工作间和匣囊制作工作间四个工作间，配备大型字画清洗台、去离子水机、密封抽风工作橱、空气洁净屏、超声波清洗机、多功能除尘工作台、环氧乙烷灭菌柜、文物修复专用喷砂机、便携式闪光X射线检查系统、立体显微成像系统等先进文物保护修复仪器和设备。近年来，将馆藏大量新疆佛经残片、康熙习字临字帖进行册页式装裱，完成罗振玉旧藏书画的修复装裱，修复一批重要的青铜器、陶瓷器、石器、丝织品等，制作了大量文物匣囊，积极申报*、省市级文物保护科技项目。还完成了大连汉墓博物馆一批20件青铜器的修复任务。
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